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认识荧光定量PCR仪的两个误区
点击次数:89 发布时间:2021-03-24
   认识荧光定量PCR仪的两个误区:
  误区一:仪器通道越多越好
  随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,荧光定量PCR仪也不能幸免。
  在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料)或Referencedye,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
  考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发,多重PCR并非人人适用、人人可用,因为它使实验复杂化了。
  误区二:荧光定量PCR仪无需梯度功能
  对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出适合的反应条件。
  不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。
  使用有梯度功能的荧光定量PCR可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程,简化了摸索PCR反应条件的繁琐实验,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。

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