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Bio-Rad伯乐PCR仪T100的这六点问题你在使用中都有遇到过吗
点击次数:36 发布时间:2019-03-15
   Bio-Rad伯乐PCR仪T100的这六点问题你在使用中都有遇到过吗
  Bio-Rad伯乐PCR仪T100的技术原理
  DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
  但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
  Bio-Rad伯乐PCR仪T100在操作中常会遇到哪些问题呢?该如何解决呢?
  1、PCR在产物序列中引入了错误,这大多是由于聚合酶忠实性低或者循环数太多,这时需要使用带有校正活性的热稳定聚合酶,同时降低循环数。此外,四种dNTP的浓度不同也会出现该问题,此时应制备新的浓度相同的dNTP混合物。
  2、PCR跑胶,目的条带很亮,但是边沿不清楚,前后有拖尾现象。出现这样的问题,则需要进行细致的分析,因为引起该问题的可能很多。可先检查是否模板质量问题,如有降解等,模板应避免反复冻融。也有可能是抽提RNA时有污染,则需要重新抽提RNA。此外,也可能是非特异性扩增引发该问题,可提高退火温度,少循环次数。电泳缓冲液时间太长,ph值和盐离子浓度明显改变、电泳时电压太高、电泳液过久没换,电泳胶脏了等都可能引发该问题。如果不是由上述原因引起,则进一步检查加样量是否过大,制胶过程中胶孔是否制好,EB是否冲洗干净、模板中是否混有基因组DNA或蛋白等。也需考虑是否扩增的条件不合适。针对具体原因再采取相应的措施。
  3、PCR产物何时需要用凝胶纯化,何时不需要?当凝胶分析扩增产物只有一条带时,则不需要使用凝胶纯化。当可见其他杂带时,则可能是积累了大量引物的二聚体,在克隆前需要做凝胶纯化。
  4、如果实验中没有回收到目的片段,则需要继续进行对照实验。包括涂布未转化的感受态细胞、转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞,按照指定的实验步骤进行。
  5、实验中出现假阳性扩增该怎么办?这是扩增系统受到污染的表现,应通过检查排除污染源。首先考虑是否为试剂污染,可将试剂分装好直接置于PCR仪中扩增进行判断。其次要考虑是否为实验室污染,可更换所用的移液器、吸咀管(离心管)等,将试验中的关键步骤转移到一个新的环境中,判断是否为实验室污染。如果是则需要对整个实验室及实验器材彻底清洗处理,保持良好的通风、清洁等。此外,还要考虑是否为采样污染,一般表现为一批结果阳性率很高,一批结果阳性率又下降很多,如此反复。解决方法为尽量使用一次试管及吸咀取样。
  6、实验中出现假阴性扩增该怎么办?首先要考虑是否为仪器故障,仪器应正常运转,尤其要注意加热温度及各管间的差异是否符合实验要求,是否出现误差等。其次要考虑是否为试剂失效或无效引起,使用有效的试剂。
  以上便是今天关于Bio-Rad伯乐PCR仪T100的这六点问题你在使用中都有遇到过吗的全部分享了,希望对大家今后使用本设备能有帮助。
 

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